pharokka是一款专用于噬菌体基因组及宏基因组的快速标准化注释工具。PS.仍在积极更新中，最近一次更新是在今年6.20。

若需对细菌基因组进行快速标准化注释，建议使用Bakta。启发pharokka开发及命名的Prokka也是优秀选择，但Bakta实为Prokka的卓越继任者。phold是同一作者开发的另一个噬菌体注释软件，其利用结构同源性来优化噬菌体注释。phold 在注释效果上显著优于 pharokka，尤其对于特征较少的噬菌体（例如来自宏基因组数据集的噬菌体）。目前，pharokka 仍具备一些 phold 尚未支持的功能（如 tRNA、tmRNA、CRISPR 重复序列识别 以及 INPHARED 分类搜索），因此建议在运行 pharokka 后再运行 phold 进行补充注释。phold 可直接将 pharokka 的 Genbank 输出文件 作为输入。也就是说，如果用 pharokka 注释过的噬菌体基因组，只需通过 phold 即可轻松升级注释结果，获得更丰富的功能预测信息。

pharokka安装和使用

如果不想安装，也有galaxy在线服务器可以使用：Galaxy Europe webserver
除了下面列出的conda，也可以使用Pip、源代码或docker等容器进行安装和使用。

# pharokka
conda install -c bioconda pharokka
# pharokka数据库下载
install_databases.py -o <path/to/databse_dir>
# 国内估计得用这个网址或想点办法
wget "https://zenodo.org/record/8276347/files/pharokka_v1.4.0_databases.tar.gz"
tar -xzf pharokka_v1.4.0_databases.tar.gz
# 注释
pharokka.py -i <phage fasta file> -o <output directory> -d <path/to/database_dir> -t <threads>
# pharokka v1.7.0 新增多序列绘图功能
pharokka_multiplotter.py -g pharokka.gbk  -o pharokka_plots_output_directory 

pharokka原理和结果说明

pharokka 是一款专为噬菌体基因组设计的快速标准化注释工具，默认使用噬菌体特异性基因预测工具 PHANOTATE（也可选 Prodigal/pyrodigal）。它通过 MMseqs2 比对 PHROGs/CARD/VFDB 数据库进行功能注释，并从 v1.4.0 起新增 PyHMMER 的隐马尔可夫模型提升 PHROGs 注释灵敏度。其核心输出包括可直接用于下游分析（如 Roary）的 GFF 文件，以及统计 CDS、tRNA、CRISPR 和功能注释的 cds_functions.tsv 文件。若需进一步优化注释，可将其 Genbank 输出导入 phold 进行基于结构同源性的增强分析。

pharokka.py [-h] [-i 输入文件] [-o 输出目录] [-d 数据库目录] [-t 线程数] [其他选项...]
- 必需参数-i 输入FASTA文件 | -o 输出目录
- 主要选项-t 线程数 | -g 基因预测工具（phanotate/prodigal） | -e E值阈值（默认1E-05）--meta 宏基因组模式 | --fast 仅用PyHMMER加速注释 | --dnaapler 自动调整基因组方向
- 高级控制--skip_extra_annotations 跳过tRNA/CRISPR检测 | --genbank 输入GenBank文件重新注释

phold安装和使用

phold 采用 ProstT5 蛋白质语言模型（深度学习模型），将氨基酸序列快速转化为 3Di 结构token编码，并通过 Foldseek 比对包含 100 万+ 噬菌体蛋白结构的数据库（该数据库主要基于 Colabfold 预测构建）。

# conda安装
mamba create -n pholdENV -c conda-forge -c bioconda phold 
# nvidia gpu版本，还有mac m芯片版本（可能用的人不多，没摘录）
mamba create -n pholdENV -c conda-forge -c bioconda phold pytorch=*=cuda*
# 运行
phold run -i tests/test_data/NC_043029.gbk  -o test_output_phold -t 8

phold结果说明

若本地工作站配备 GPU，建议使用完整流程命令phold run，如果没有gpu，添加–cpu参数。

phold run 命令核心参数说明▌ 基础参数-i  输入文件路径 (必需，支持GenBank/FASTA格式)-o  输出目录 [默认: output_phold]-t  线程数 [默认: 1]-p  输出文件前缀 [默认: phold]▌ 数据库与性能-d  指定phold数据库路径--batch_size  ProstT5批处理大小 [默认1，推荐GPU使用]--cpu         强制使用CPU模式--keep_tmp_files 保留临时文件（含完整Foldseek结果）▌ 高级分析选项-e  Foldseek E值阈值 [默认1e-3]--card_vfdb_evalue  CARD/VFDB专用E值 [默认1e-10]--ultra_sensitive  超敏感模式（跳过预过滤，小数据集适用）--only_representatives 仅比对聚类代表序列▌ 特殊功能--separate  为每个contig生成独立GenBank文件--finetune  启用实验性PhrostT5微调模型（不推荐常规使用）--save_per_residue_embeddings 保存残基级嵌入数据使用示例：
phold run -i input.gbk -o results -t 8 --batch_size 4注：GPU环境下推荐直接使用默认参数运行，大数据集建议调整--max_seqs限制结果数量
_aa.fasta
保存所有预测编码序列（CDS）的氨基酸序列_3di.fasta
包含由ProstT5预测的所有CDS的Foldseek 3Di结构序列.gbk
生成包含完整注释信息的GenBank格式文件_all_cds_functions.tsv
按contig统计的汇总数据：CDS总数各PHROG功能分类的CDS数量CARD/VFDB/Defensefinder/ACR数据库匹配的CDS数量_per_cds_predictions.tsv
每个CDS的详细注释信息表注：所有输出文件均以用户指定的前缀开头（默认"phold_"）3Di序列文件可用于后续结构比对研究

参考：

• https://github.com/gbouras13/phold
• https://github.com/gbouras13/pharokka
• Galaxy Europe webserver：https://usegalaxy.eu/?tool_id=toolshed.g2.bx.psu.edu%2Frepos%2Fiuc%2Fpharokka%2Fpharokka%2F1.2.1%2Bgalaxy1&version=1.2.1%20galaxy1