在微生物实验中，细菌浓度的精准测定和菌种的准确鉴定是两项基础且核心的操作。本文将详细介绍相关技术的原理、操作步骤及注意事项，为新手提供系统性指导。

一、细菌浓度测定方法

1. 光密度法（OD600）：快速定量的首选

原理

OD600 测定基于光散射原理：当 600nm 波长的光穿过菌液时，细菌会对光产生散射，散射强度与菌液中细菌浓度在一定范围内（通常 0.1-0.8 OD 值）呈线性正相关。需注意，超过此范围后线性关系会偏离，例如大肠杆菌在 OD600>0.8 时，数据准确性显著下降。

操作步骤

• 仪器校准：以空白培养基作为对照调零，建议使用中性密度滤光片验证仪器精度；固定使用同一台仪器，并记录比色皿光程（通常为 1cm）。
• 样品准备：轻柔混匀菌液（避免产生气泡影响测定），若 OD 值超过 0.8，需用无菌培养基稀释至 0.1-0.8 范围后再测定。
• 测量操作：用擦镜纸清洁比色皿外壁，每个样品读取 3 次取平均值，以减少误差。
• 浓度计算：最终浓度 = 测定 OD 值 × 稀释倍数。建议提前绘制 OD 值与活菌数（CFU）的标准曲线，便于直接换算活菌浓度。

注意事项

• 若培养基颜色较深，可通过离心收集细菌沉淀，用 PBS 洗涤后重悬再测定，避免背景干扰。
• 不同仪器的测定结果存在差异，需固定仪器并定期校准，记录光程参数以保证数据可比性。

2. 平板计数法：活菌定量的 “金标准”

核心概念：CFU

CFU（菌落形成单位）指能在固体培养基上形成一个菌落的活细菌个体（可能是单个细菌或团聚的细菌群），仅反映活菌数量，是活菌定量的直接方法。

计算公式

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CFU/mL =（菌落数 × 稀释倍数）÷ 接种体积（mL）

操作流程

• 样品稀释：采用无菌生理盐水或 PBS 进行 10 倍梯度稀释（如 10⁻¹ 至 10⁻⁸），每稀释度更换无菌枪头，防止交叉污染。
• 培养基制备：选择适宜的固体培养基（如 LB 琼脂），灭菌后冷却至 50℃左右倒平板，90mm 直径平板的培养基用量约 20mL，厚度均匀可保证菌落生长一致性。
• 接种方法：
  • 涂布法：取 100μL 稀释液滴加至平板，用无菌涂布棒均匀涂布。
  • 倾注法：取 1mL 稀释液与融化的琼脂培养基混合后倒平板。
• 培养条件：根据细菌特性设置温度（通常 30-37℃），培养 18-48 小时，保持培养环境湿度适宜。
• 计数规则：选择菌落数在 30-300 之间的平板计数，菌落数过少或过多均会导致结果偏差，可借助菌落计数器提高效率。

二、菌种鉴定技术

1. 传统鉴定方法

革兰氏染色：细胞壁特性鉴别

• 原理：革兰阳性菌细胞壁较厚，含肽聚糖多，与结晶紫结合稳定，经酒精脱色后仍保留紫色；革兰阴性菌细胞壁薄，肽聚糖少，结晶紫易被洗脱，复染后呈红色。
• 操作要点：
  • 涂片厚度适中，避免重叠影响观察。
  • 染色步骤严格控制时间：结晶紫染色 1 分钟→碘液媒染 1 分钟→酒精脱色 30 秒（关键步骤，时间需精准）→番红复染 30 秒。

氧化酶试验：呼吸类型辅助判断

• 原理：检测细菌是否含细胞色素 c 氧化酶，阳性菌可使四甲基对苯二胺试剂在 30 秒内变蓝，阴性菌无颜色变化。
• 注意事项：使用新鲜培养的细菌，避免用含铁工具接触试剂，防止假阳性。

2. 分子鉴定方法：精准到种级

16S rRNA 测序：细菌 “分子身份证”

• 原理：16S rRNA 基因在细菌中高度保守且种间存在特异性差异，长度约 1500bp，数据库完善，通过序列比对可实现精准鉴定。
• 操作关键：
  • DNA 提取：选用对数期细菌（OD600≈0.6），革兰阳性菌需用溶菌酶预处理以破坏细胞壁，提取后用 RNase 去除 RNA 污染。
  • PCR 扩增：常用引物 27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）；反应程序：94℃预变性 5 分钟，35 个循环（94℃变性 30 秒→55℃退火 30 秒→72℃延伸 90 秒），最后 72℃延伸 10 分钟。
  • 序列分析：拼接测序结果后，通过 NCBI BLAST 等工具与数据库比对，确定菌种分类。

总结

细菌浓度测定中，OD600 法适合快速定量，平板计数法适合活菌精准计数，两者可结合使用（如通过标准曲线关联 OD 值与 CFU）。菌种鉴定方面，传统方法（革兰氏染色、生化试验）可快速初步分类，分子方法（16S rRNA 测序）可实现精准鉴定。实际操作中需根据实验目的选择合适方法，并严格遵循无菌操作与实验规范，以保证结果可靠性。

通过掌握上述基础技术，可为后续微生物功能研究、发酵优化等实验奠定坚实基础。