通过多区域单细胞测序解析肺腺癌的空间和细胞结构
摘要
对于肺腺癌演进过程中单个细胞群的地理空间架构知之甚少。在此，我们对来自5例早期LUAD和14个来自肿瘤的具有明确空间邻近性的多区域正常肺组织的186，916个细胞进行了单细胞RNA测序。我们发现细胞谱系、状态和转录组特征在正常区域到LUAD的地理空间上发生了演变。LUAD还表现出单个部位内显著的肿瘤内细胞异质性以及转录谱系可塑性程序。与肿瘤邻近的正常组织中调节性T细胞表型增加，而细胞毒性CD8+T细胞、抗原呈递巨噬细胞和炎症树突状细胞的特征和比例则减少。我们还发现LUAD配体-受体相互作用组中上皮CD24的表达增加，其介导了促肿瘤表型。这些数据提供了LUAD演进的空间图谱，并为识别其治疗靶点提供了资源。
数据收集
LUAD patient
软件使用
软件包信息
软件名称 | 版本 | 类型 | 应用领域 | 官方链接 |
|---|---|---|---|---|
| NovaSeq 6000 | - | 测序平台 | 高通量测序 | illumina.com |
| 10X Genomics | - | 单细胞平台 | 单细胞测序 | 10xgenomics.com |
| Seurat | - | R包 | 单细胞分析 | satijalab.org/seurat |
| Seurat v3 | - | R包 | 单细胞分析 | satijalab.org/seurat |
| Harmony | - | R包 | 批次校正 | github.com |
| Monocle 2 | 2.10.1 | R包 | 拟时序分析 | bioconductor.org |
平台与工具关系
graph LR
A[NovaSeq 6000] -->|生成数据| B[10X Genomics]
B -->|CellRanger处理| C[Seurat]
C -->|整合分析| D[Harmony]
C -->|轨迹分析| E[Monocle 2]统计方法信息
参数检验
非配对Student's t检验 (Unpaired Student's t-test)
核心假设：
正态性（Shapiro-Wilk检验p>0.05）
方差齐性（Levene检验p>0.05）
观测独立性
R语言实现：
# 标准t检验（方差齐） t.test(value ~ group, data, var.equal = TRUE)# Welch校正（方差不齐） t.test(value ~ group, data, var.equal = FALSE)
实验验证方法
多区域样本采集与处理
目的
解析肺腺癌瘤内异质性和微环境特征
实验设计
样本类型：
肿瘤核心区（≥3个解剖位置）
肿瘤-正常交界区
远端正常肺组织（距肿瘤>5cm）
采样规范：
graph TDA[手术切除] --> B(30分钟内处理)B --> C{分区取样}C --> D[肿瘤中心]C --> E[浸润边缘]C --> F[远端正常]
研究成果
通过多区域单细胞RNA测序剖析早期肺腺癌及周围肺部生态系统
A 展示了针对5个肺腺癌样本和14个具有明确空间定位的正常肺组织，采用多区域采样策略进行单细胞RNA测序分析的流程图。
B 来自患者一的肿瘤样本、邻近正常样本和远端正常样本的细胞的均匀流形逼近与投影嵌入图。
C 每个空间样本中细胞的绝对数量组成和相对比例分别来自P1。
D 来自所有5名患者的细胞的UMAP视图，包括P2-P5中的EPCAM+和EPCAM-前富集细胞。
E 基于空间样本的细胞类型及其比例的UMAP视图。
F 显示基于使用转录组特征计算的欧几里得距离的空间样本中细胞之间层次关系的树状图。
G 与图D中相同的UMAP，还包括淋巴细胞和髓细胞的进一步分层。
H-I 折线图展示了所有患者总体以及按患者划分的各空间样本中EPCAM阴性子集的相对比例变化情况。
早期肺腺癌空间生态系统中的上皮细胞谱系多样性及肿瘤内异质性
A、所有EPCAM+细胞的UMAP图形展示。
B、EPCAM+细胞簇的主要谱系标记基因热图，同时附有相应的条形图，用于说明不同空间样本中的比例情况。
C、显示不同空间样本中EPCAM+子集比例变化的面积图。
D、基于计算的欧几里得距离使用转录组特征对空间样本中的3个代表性上皮细胞子集之间的层次关系进行展示，以及相应量化空间样本之间相似度水平的热图。
E、恶性富集簇C9中细胞的UMAP图形，按其对应的患者来源、空间样本和CNV分数进行着色。
F、携带KRAS G12D突变的细胞比例，数字表示绝对细胞数量，以及表达水平。
G、通过使用NK细胞作为对照，对来自患者P3和P5肿瘤样本的CNV路径图进行无监督聚类分析
H、通过Monocle 3分析推断出P3和P5中EPCAM+细胞的潜在发育轨迹。
早期肺腺癌中淋巴细胞亚群向肿瘤相关表型的时空重编程
A、对P1-P5时期淋巴细胞亚群进行的UMAP可视化处理，按细胞谱系和空间样本进行着色。
B、气泡图展示谱系标志物的表达情况。
C、在LUAD和空间正常样本中淋巴细胞谱系及细胞状态的变化情况。
D、对CD8+T淋巴细胞进行UMAP可视化处理，按细胞状态、空间样本和细胞毒性评分进行着色
E、在肺癌组织微环境中清除CD8+GNLY高表达的CTL细胞。
F、CD4 T淋巴细胞的UMAP图。
G、在LUAD的肿瘤微环境中CD4+T调节细胞的富集情况。
早期肺癌组织微环境中抗原呈递和炎症性树突状细胞的特征显著减少
A 早期LUADA微环境中抗原呈递和炎症树突细胞的特征减少，髓系细胞谱系的UMAP可视化图以及空间样本。
B 图展示髓系细胞表达谱系特异性标记基因的百分比以及它们的缩放表达水平）。
C 图显示LUAD及空间正常肺样本中髓系细胞亚群的丰度变化。
D 图是单核细胞和巨噬细胞亚群的UMAP图，按细胞类型/状态、空间样本和抗原呈递评分进行颜色编码。
E 图显示空间样本中表达抗原呈递基因的M2型巨噬细胞簇1的百分比及其缩放表达水平。
F 图是脊线图。在M2型巨噬细胞簇1中以及在LUAD样本和空间正常肺样本中，MHC类I和MHC类 II基因表达密度的分布情况如下。
G 箱线图展示了所有患者以及患者内部在LUAD和空间正常肺样本中M2型巨噬细胞的抗原呈递评分。
H 树突状细胞的UMAP图，根据细胞状态进行颜色编码和空间样本。
I UMAP图显示cDC2细胞的无监督子聚类，根据簇ID进行着色、空间样本以及计算出的炎症特征评分。
J 显示cDC2细胞亚群标记基因的标准化表达的热图。
K 气泡图显示表达炎症和非炎症特征基因的cDC2细胞的百分比以及其缩放表达水平。
L 显示了细胞中炎症特征评分在来自cDC2集群C2的TME中的表达情况的维尼图图示。
M 展示了cDC2 C2细胞在总cDC2细胞中的比例以及在LUAD和空间正常肺组织中的分布情况的箱线图。
N 展示了正常肺、癌前不典型腺瘤样增生以及来自独立队列的LUAD中的炎症特征评分
增强的配体-受体细胞-细胞间通讯网络在肺腺癌细胞与其免疫微环境之间
A. 利用iTALK进行细胞间通讯的计算分析工作流程。
B. 热图显示了基于预测的配体-受体相互作用在个体LUAD与相应空间分布的正常肺组织之间的重叠情况。
C-F. 代表性的环形图展示了患者2、3、4和5的免疫检查点介导的L-R对之间的详细比较。
G-H. 条形图显示了涉及免疫检查点的配体和受体基因的表达。
与肺腺癌中CD24增多相关的促肿瘤表型
A、箱线图展示在一组独立的正常肺组织、癌前不典型腺瘤样增生以及肺腺癌样本中CD24表达水平的情况
B、使用皮尔逊相关系数绘制的散点图，展示NL、AAH和LUAD样本中CD24与EPCAM和PRF1的水平关系。
C、箱线图描绘了TCGA LUAD队列中LUAD和匹配的正常肺组织中CD24表达水平
D、使用皮尔逊相关系数展示CD24与EPCAM或PRF1表达之间的相关性散点图。
E、通过靶向免疫分析对早期LUAD患者进行分析，并根据中位CD24 mRNA表达进行二分
F、散点图展示使用皮尔逊相关系数展示CD24与EPCAM、PRF1或细胞毒性评分在MDACC队列中的表达相关性。
G、显示相对较高和较低免疫组化CD24染色的代表性图像。
H、体内MDA-F471细胞的生长情况
Reference
Sinjab A, et al. Resolving the Spatial and Cellular Architecture of Lung Adenocarcinoma by Multiregion Single-Cell Sequencing. Cancer Discov. 2021 Oct;11(10):2506-2523. doi: 10.1158/2159-8290.CD-20-1285. Epub 2021 May 10. PMID: 33972311; PMCID: PMC8487926.
