前言

**sORF（small Open Reading Frame，小开放阅读框）**在基因组中广泛存在，越来越多研究发现它们具有重要的生物学功能。如何判断一个sORF是否具有编码蛋白的潜能？**CPAT（Coding Potential Assessment Tool）**是目前主流的编码潜能预测软件之一。本文将手把手教你如何用CPAT预测sORF的编码潜能，适合Ribo-seq、转录组等多种场景。

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一、准备工作

1. 安装CPAT

CPAT支持Python 2和3，推荐用conda安装：

conda create -n cpat python=3.8
conda activate cpat
pip install CPAT

或直接用pip：

pip install CPAT

2. 下载物种特异性模型

CPAT需要物种特异性的训练模型。人、小鼠、斑马鱼等常见物种可在CPAT官网下载。
如需自建模型，可参考官方文档。

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二、准备sORF核酸序列

1. 获取sORF的拼接核酸序列

• 注意：CPAT的输入必须是拼接后的ORF核酸序列（即mRNA区段），不能直接用基因组区间！
• 推荐流程：
  1. 用RiboCode等工具注释sORF，获得GTF和外显子区间，参照文章 2025.06.11【Ribo-seq】|根据注释文件获取外显子及ORF序列
  2. 用bedtools和Python脚本拼接外显子，得到每个sORF的完整核酸序列（FASTA格式）。

示例脚本（假设已获得外显子fasta）：

from Bio import SeqIO
from collections import defaultdict
import reexon_seqs = list(SeqIO.parse("orf_exons.fa", "fasta"))
orf_exons = defaultdict(list)
for record in exon_seqs:m = re.match(r"(.+?)::(.+?):(\d+)-(\\d+)\\(([-+])\\)", record.id)if not m:continueorf_id, chrom, start, end, strand = m.groups()start = int(start)orf_exons[(orf_id, strand)].append((start, record.seq))with open("orfs.fa", "w") as out:for (orf_id, strand), exons in orf_exons.items():exons.sort(reverse=(strand == "-"))seq = "".join(str(seq) for _, seq in exons)if len(seq) < 300:  # 只保留小于300nt的sORFout.write(f">{orf_id}\\n{seq}\\n")

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三、运行CPAT预测编码潜能

1. 准备CPAT模型和hexamer表

以人类为例，假设模型和hexamer表为：

• Human_logitModel.RData
• Human_Hexamer.tsv

2. 运行CPAT

cpat.py -g orfs.fa \-d Human_logitModel.RData \-x Human_Hexamer.tsv \-o cpat_result.txt

参数说明：

• -g：输入的sORF核酸序列（FASTA格式）
• -d：物种特异性模型
• -x：hexamer表
• -o：输出结果

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四、结果解读

输出文件cpat_result.txt包含如下主要字段：

ID	mRNA_size	ORF_size	Fickett_score	Hexamer_score	Coding_prob
…	…	…	…	…	…

• Coding_prob：编码潜能概率，越接近1越可能编码蛋白。
• 一般阈值：人类推荐0.364，具体可参考CPAT官方或文献。

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五、常见问题与排查

1. 报“No ORFs found for …”怎么办？

• 检查输入序列是否为拼接后的ORF区段，且包含ATG起始和终止密码子。
• 检查FASTA格式是否正确。
• 检查序列是否过短或有N等不明碱基。

2. 可以直接用基因组区间序列吗？

不可以！
必须用拼接后的ORF核酸序列，否则会混入内含子，导致预测结果不准确。

3. 如何批量筛选高编码潜能的sORF？

awk '$6 > 0.364' cpat_result.txt > cpat_high_coding.txt

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六、总结

• CPAT是sORF编码潜能预测的利器，但输入必须是拼接后的ORF核酸序列。
• 推荐结合RiboCode、bedtools、Python脚本等工具，批量提取sORF序列。
• 结果需结合生物学背景和其他证据综合判断。

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